• التقنيات المختلفة لاستخلاص وتحليل البروتينات
يمكن فصل البروتينات على أساس شحنتها بواسطة تقنية تسمى «Ion-exchange Chromatography» حيث إذا كان للبروتين شحنة موجبة عند الرقم الهيدروجيني 7 فعادة ما يرتبط بعمود من الحبيبات يحتوي على مجموعات الكربوكسيل في حين أن البروتين سالب الشحنة لن يرتبط بنفس الكيفية. يمكن بعد ذلك استخلاص بروتين موجب الشحنة المرتبط بالعمود عن طريق زيادة تركيز كلوريد الصوديوم أو ملح آخر في محلول الإذابة «Elution Buffer» لأن أيونات الصوديوم تتنافس مع المجموعات موجبة الشحنة في البروتين للارتباط بالعمود. تميل البروتينات التي تحتوي على كثافة منخفضة من الشحنة الموجبة إلى الظهور أولا يليها البروتينات التي تحتوي على كثافة شحنة أعلى.
تعد تقنية «Affinity Chromatography» أو التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي وسيلة أخرى قوية وقابلة للتطبيق بشكل عام لتنقية البروتينات. حيث تستفيد هذه التقنية من التجاذب الشديد للعديد من البروتينات مع مجموعات كيميائية محددة. على سبيل المثال يمكن استخلاص البروتين النباتي «كونكانافالين» عن طريق تمرير مُستخلص به العديد من البروتينات عبرعمود من الحبيبات يحتوي على مجموعات الجلوكوز المرتبطة تساهميا. حيث يرتبط هذا البروتين بالعمود لأنه يتجاذب مع الجلوكوز في حين أن معظم البروتينات الأخرى لا تفعل ذلك. وتعتبر هذه التقنية أيضا من الوسائل القوية لعزل انزيمات النسخ في الخلية والبروتينات التي تنظم التعبير الجيني عن طريق الارتباط بتسلسلات معينة من الحمض النووي. حيث يتم ترشيح خليط البروتين من خلال عمود يحتوي على تسلسلات الحمض النووي محددة والبروتينات ذات التجاذب العالى للتسلسل سترتبط ويتم الاحتفاظ بها في هذه الحالة ثم يتم تحرير انزيمات النسخ عن طريق الذوبان في محلول يحتوي على تركيز عالِ من الملح.
يمكن تحسين قوة فصل جميع التقنيات التي تستخدم التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي بشكل كبير من خلال استخدام تقنية تسمى «high-pressure liquid chromatography HPLC» وهي تعتبر نُسخة مُحسنة من التحليل الكروماتوجرافي الانجذابي. حيث يتم تقسيم مواد العمود نفسها بشكل أكثر دقة ونتيجة لذلك هناك المزيد من مواقع التفاعل وبالتالى قوة فصل أكبر. نظرا لأن العمود مصنوع من مادة دقيقة يجب تطبيق الضغط على العمود للحصول على معدلات تدفق مناسبة والنتيجة هي دقة عالية وكذلك فصل سريع. يمكن أيضا فصل البروتينات عن طريق التفريد الكهربائي حيث تعمل هذه الوسيلة على فصل البروتينات والجزيئات الكبيرة الأخرى وتعتمد سرعة هجرة البروتين داخل المجال الكهربائي على شدة المجال وشحنة البروتين ومعامل الاحتكاك. تتعارض القوة الكهربائية التي تدفع الجزئ المشحون نحو القطب المشحون بشكل معاكس بواسطة السحب اللزج الناتج عن الاحتكاك بين الجزئ المتحرك والوسط. ويعتمد معامل الاحتكاك على كل من كتلة وشكل الجزئ المهاجر ولزوجة الوسيط. يمكن أيضا فصل البروتينات بشكل كهربائي على أساس محتوياتها النسبية من مخلفاتها الحمضية والقاعدية. حيث يتم فصلها وفقا لنقطة تساويها الكهربية بالتركيز الكهربي وتسمى هذه التقنية باسم التركيز الكهروضوئي. حيث يعتمد مبدأها على انتقال البروتينات إلى درجة الحموضة المتساوية كهربيا وهو المكان الذي لا يوجد فيه شحنات. يمتلك كل مختبر طريقته المناسبة لفصل البروتينات وتختلف من مختبر لآخر، ولكن جميع الطرق تمتلك خطوات ثابتة نادرا ما تختلف. لذلك لابد من الإطلاع وفهم الخطوات الأساسية أولا قبل التعمق في تفاصيل الطرق المختلفة.
الكاتب: فاطمة سيد
